Inizialmente l’Ordine fu generosamente appannato dal Granduca, poi grazie ad oculati acquisti di tenute agricole, accrebbe il proprio patrimonio diventando tra i maggiori produttori e mercanti di grano della Toscana. Tre erano le categorie di partecipanti all’Ordine, ciascuna divisa in due sottocategorie: militi (conventuali e commendatori), sacerdoti (conventuali e d’obbedienza) e serventi (d’arme e di stallo, questi ultimi in realtà non appartenenti all’ordine); ciascun livello richiedeva dei precisi requisiti: solo coloro che potevano dimostrare quattro quarti di nobiltà (cioè nobiltà di tutti i nonni, materni e paterni) potevano accedere alle cariche di cavaliere milite o sacerdote conventuale, così com’è attualmente.
I cavalieri militi erano tenuti a profferire i tre voti di castità coniugale, carità e obbedienza e tali voti sono sempre rimasti nei vari Statuti dell’Ordine, fino all’attuale; era tuttavia facoltà del Gran Maestro dispensare dai voti. Erano previsti altri riconoscimenti al merito e altre classificazioni gerarchiche legate all’organizzazione interna dell’ordine (Priori, Balì, ecc.).
Prima di venire arruolati nell’Ordine si dovevano seguire tre anni di noviziato, durante i quali venivano impartite nozioni di geometria, cosmografia, aritmetica, disegno, cartografia, storia, pratica delle armi da punta e da fuoco; veniva inoltre provato l’imbarco su una galea dell’Ordine.
La carica di Gran Maestro spettava al capo della famiglia granducale di Toscana. Il governo interno era retto da un capitolo generale, cioè l’assemblea di tutti i Cavalieri tenuta a scadenza triennale, da un consiglio provinciale (presto dimesso) e dal consiglio dei Cavalieri composto inizialmente di dodici membri (poi ridotto alle cinque grandi cariche). Nella pratica però l’autorità si concentrava nelle mani dell’auditore, scelto direttamente dal sovrano, e poi subordinatamente ai Cavalieri di Gran Croce, i grandi dignitari dell’Ordine specializzati in vari settori organizzativi.
Attualmente l’Ordine conta circa 75 cavalieri (balì gr. cr. di giust.,cav. e cav. gr. cr. di giustizia, sacerdoti e cappellani) e ne è gran maestro S.A.I. e R. il principe Sigismondo d’Asburgo-Lorena arciduca d’Austria, capo della casa granducale di Toscana.
Gran cancelliere è il N. H. Francesco d’Ayala-Valva dei Conti di Recalmuto. Per la parte spirituale, opera un “Cappellano Maggiore” nominato internamente all’Ordine stesso come prevede lo Statuto.
Canonicamente oggi si configura come erede dell’Ordine di fondazione pontificia. È prevista dallo Statuto e da apposito Regolamento, con assoluta continuità dall’antico, l’emanazione di speciali promesse di castità coniugale, carità e obbedienza (“professione stefaniana”), dalla quale però il Gran Maestro può dispensare.
L’Ordine è riconosciuto dallo Stato Italiano attraverso le autorizzazioni all’uso concesse dal Ministro per gli affari esteri.
Esiste in Pisa l’Istituzione dei Cavalieri di Santo Stefano (Fondazione italiana nata nel 1939) che avvalendosi dell’Accademia di Marina dei Cavalieri di Santo Stefano (ambedue del tutto indipendenti dall’Ordine), si occupa del mantenimento della memoria storica del glorioso Ordine